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在研究蛋白互作的實(shí)驗(yàn)中，蛋白樣本制備的質(zhì)量對(duì)后續(xù)western blot或質(zhì)譜分析影響頗深。

蛋白樣本的制備質(zhì)量，并不僅限于蛋白提取，后續(xù)可能需要進(jìn)行的蛋白濃縮、標(biāo)簽蛋白純化也是樣本制備的關(guān)鍵操作，每一樣都馬虎不得。

裂解除雜：打破細(xì)胞壁壘，提純蛋白的

“清道夫”法則

我們先從蛋白提取說起。傳統(tǒng)的細(xì)胞樣本提取蛋白，再到后續(xù)的western blot結(jié)果分析是比較簡(jiǎn)單的，但如果你的樣本是表達(dá)重組蛋白的菌體，那么在使用RIPA裂解后，有時(shí)我們會(huì)發(fā)現(xiàn)裂解物比較黏稠，再接著往下做直到western blot結(jié)果出來后可能會(huì)看到一些莫名其妙的條帶拖尾。

這時(shí)，我們的第一反應(yīng)可能是：哎呀，樣本要么有雜質(zhì)要么降解了。

如果是雜質(zhì)，那這雜質(zhì)到底是啥？知其然才能確保下次不出問題。其實(shí)，這里可能是因?yàn)榇罅勘磉_(dá)重組蛋白的菌體，在裂解后會(huì)釋放出很多染色體DNA——這就是裂解物黏稠的來源，它在后續(xù)的電泳中影響蛋白移動(dòng)，最終造成顯影結(jié)果呈現(xiàn)拖尾。

我們可以通過3個(gè)小辦法來改善：一是改用針對(duì)不同物種樣品而優(yōu)化配方的裂解液，其本質(zhì)是優(yōu)化了去污劑配方，讓細(xì)胞裂解效率更高的同時(shí)保持生物活性，第二，在改善裂解液的基礎(chǔ)上，配合超聲同步處理樣本，超聲產(chǎn)生的剪切力可以切斷染色體長(zhǎng)鏈DNA；三是在裂解時(shí)再搭配核酸酶除核酸，通常核酸酶是需要單獨(dú)加入的，有的核酸酶定向切割DNA，有的則不區(qū)分核酸種類，直接把核酸降解為幾個(gè)bp長(zhǎng)度的小片段。

超濾濃縮：精準(zhǔn)把控蛋白濃度，濃縮過程中的

“節(jié)流”與“開源”

選擇合適的樣品除雜方法可以提高結(jié)果的質(zhì)量。但有時(shí)蛋白少得可憐，別說雜質(zhì)了，目的條帶都不一定能看到——比如讓當(dāng)我們要研究分泌型的蛋白時(shí)。

研究分泌型蛋白，要從培養(yǎng)物上清獲蛋白。細(xì)胞什么時(shí)間周期進(jìn)行分泌？是否采用了合適的誘導(dǎo)方法促進(jìn)分泌？有時(shí)，即便已經(jīng)采用了合適的方法獲得蛋白，但濃度卻不一定能滿足下游的IP分析。這時(shí)，就要考慮蛋白濃縮。

選擇超濾濃縮還是凍干濃縮更合理？?jī)龈蓾饪s的效果可能更好，但是凍干過程有可能造成蛋白的穩(wěn)定性破壞，進(jìn)而影響IP實(shí)驗(yàn)的抗體結(jié)合效率，而且凍干后的蛋白還需要考慮復(fù)溶的條件，操作復(fù)雜，還需要專門的設(shè)備。相比之下，通過超濾濃縮更適合處理分泌型蛋白含量低的問題。

超濾濃縮前，我們特別應(yīng)該關(guān)注2個(gè)細(xì)節(jié)：樣品前處理和選擇合適的超濾管。

第一，應(yīng)該先通過4℃，10,000×g離心去除上清中的大體積雜質(zhì)和細(xì)胞碎片。

第二，選擇合適的超濾管，這里的合適不僅包括截留分子量，還包括了濾膜材質(zhì)。截留分子量大小應(yīng)該約為如果我們研究的蛋白大小的1/3甚至更低，比如30 kDa的蛋白，就應(yīng)該選擇10 kDa的超濾管。而濾膜材質(zhì)的選擇，更多的應(yīng)該從化學(xué)兼容性以及對(duì)蛋白吸附效果兩點(diǎn)出發(fā)考慮。這里建議同學(xué)們通過產(chǎn)品說明書上提供的化學(xué)兼容性表查詢確認(rèn)即可，而對(duì)于分泌型蛋白，應(yīng)該優(yōu)先選用低蛋白吸附的再生纖維素膜材質(zhì)的超濾管，這樣可以避免本就少得可憐的蛋白的二次流失。

標(biāo)簽融合表達(dá)：給蛋白裝上“導(dǎo)航儀”，

讓分離純化事半功倍

如果你的研究特別超前或小眾——比如要做Co-IP卻發(fā)現(xiàn)待測(cè)蛋白居然找不到合適的商用抗體。那么，接下來的樣本制備思路可能對(duì)你有啟發(fā)。

首先，我們必須意識(shí)到，Co-IP下游檢測(cè)不一定依賴Western blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)，蛋白互作沉淀后通過SDS-PAGE電泳分離條帶，再利用LC-MS/MS分析互作蛋白，也可以確認(rèn)待測(cè)蛋白信息。這個(gè)過程不需要抗體，它主要依賴足夠的蛋白量以及可供燃燒的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)。

另外一種思路則是構(gòu)建標(biāo)簽表達(dá)載體，將待測(cè)蛋白的基因克隆到含有標(biāo)簽的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞，并過表達(dá)帶上標(biāo)簽的待測(cè)蛋白。進(jìn)入Co-IP階段后，用已知蛋白的IP抗體來做免疫沉淀，Western blot階段再使用標(biāo)簽抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白。

通過融合標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)間接檢測(cè)是一種比較經(jīng)濟(jì)的做法，我們需要關(guān)注的點(diǎn)主要是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括：選擇合適的標(biāo)簽和設(shè)計(jì)合理對(duì)照。

常見的標(biāo)簽有FLAG、GST、His、Myc、HA等，如果下游實(shí)驗(yàn)是Co-IP/IP，建議大家優(yōu)先考慮FLAG標(biāo)簽，因?yàn)镕LAG標(biāo)簽較短、對(duì)蛋白空間構(gòu)象的影響較小，——盡量降低外部標(biāo)簽對(duì)蛋白的折疊、活性以及相互作用的干擾。

其次，就是設(shè)計(jì)合理對(duì)照，因?yàn)檫^表達(dá)帶標(biāo)簽的待測(cè)蛋白后，細(xì)胞可能無法完成大量外源蛋白的正確折疊，導(dǎo)致蛋白出現(xiàn)異常聚集，這些異常的蛋白就可能無法參與蛋白互作。因此，控制轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？偭俊⒃O(shè)置多個(gè)轉(zhuǎn)染梯度的對(duì)照實(shí)驗(yàn)是有必要的。