*，Western blot(WB)和免疫組化(IHC)都屬于免疫學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。WB是通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到固相載體上，利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理進(jìn)行樣品檢測(cè)，可用于定性和半定量。而IHC是融合了免疫學(xué)原理(抗原抗體特異性結(jié)合)和組織學(xué)技術(shù)(組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，對(duì)組織(細(xì)胞)內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及通過(guò)Image J進(jìn)行定量的研究(主要是定位)。與WB相比，IHC實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，涉及的試劑和物品種類繁多，所以IHC的垃圾分類更要認(rèn)真對(duì)待。那么，IHC實(shí)驗(yàn)中的垃圾到底有哪些？又該如何分類呢？古朵小編從IHC的實(shí)驗(yàn)步驟開(kāi)始和大家逐一敘述。
 

 

　　IHC(石蠟切片)都有哪些步驟
 

　　一、 石蠟組織切片制作
 

　　固定：使組織樣本盡量保持其離體前狀態(tài)，多采用4%多聚甲醛固定液。
 

　　脫水：水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進(jìn)入。使用梯度乙醇進(jìn)行脫水。75%、85%、95%、*、*乙醇，每步1h-2h左右。
 

　　透明：乙醇不能與石蠟相溶，還需用能與乙醇和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的乙醇。二甲苯是常用的透明劑，可以很好地與石蠟互溶。將組織依次放入二甲苯與無(wú)水乙醇的等體積混合液、純二甲苯和純二甲苯中進(jìn)行透明。
 

　　浸蠟與包埋：用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用，便于在切片機(jī)上夾持切片。用于包埋石蠟的熔點(diǎn)在50~60℃之間。
 

　　切片：將包埋組織的蠟塊固定在切片機(jī)上，切片厚度一般為4~8μM。
 

　　貼片：把切片放入50℃水中，攤平后用多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片撈起，室溫晾干。
 

　　二、 脫蠟復(fù)水
 

　　干燥后的切片需脫蠟及復(fù)水才能在水溶性染液中進(jìn)行染色。如果不經(jīng)過(guò)復(fù)水，直接進(jìn)入染色劑中，材料將會(huì)嚴(yán)重變形，甚至難以染色。
 

　　先烤片，將切片放于60℃烘箱中烘烤。
 

　　二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10~15min。
 

　　放入*、*、95%、85%、75%等梯度乙醇溶液中各3min。
 

　　放入蒸餾水洗兩次×5min。PBS(或PBST)洗三次×3 min。
 

　　三、 抗原修復(fù)
 

　　甲醛的固定使細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。在染色前需進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。
 

　　將切片浸入0.01M檸檬酸鹽緩沖液中，再放入微波爐中加熱10 min，之后冷卻切片。或者，用EDTA-*消化液37℃消化10 min。
 

　　PBS(或PBST)洗三次×3 min。用吸水紙將切片組織周圍擦干。
 

　　四、 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶
 

　　去除組織中的內(nèi)源性酶催化底物，避免染色的非特異性。
 

　　用免疫組化筆圈出樣品，滴加3%*孵育10min。
 

　　PBS(或PBST)洗三次×3 min。
 

　　五、 封閉
 

　　為減少背景產(chǎn)生的非特異性染色，使用非免疫動(dòng)物血清進(jìn)行封閉。
 

　　滴加動(dòng)物血清封閉液，室溫封閉30min。
 

　　甩去多余液體，用吸水紙將切片組織周圍擦干。
 

　　六、 抗體結(jié)合
 

　　滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜。
 

　　PBS(或PBST)洗三次×3 min。
 

　　滴加辣根酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育30min。
 

　　PBS(或PBST)洗三次×3 min。
 

　　七、 底物顯色
 

　　DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度，然后PBS或自來(lái)水沖洗1min。
 

　　八、 復(fù)染
 

　　襯托出組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。
 

　　蘇木素復(fù)染1-3min。
 

　　PBS或自來(lái)水沖洗1min。
 

　　九、 分化
 

　　1%的鹽酸酒精分化2～3秒，PBS或自來(lái)水沖洗兩次×5min。
 

　　十、 脫水和透明
 

　　75%，85%，95%，*，*的乙醇浸泡各2min。
 

　　二甲苯浸泡兩次×2min。
 

　　十一、 封片
 

　　用蓋玻片和中性樹膠進(jìn)行封片。之后鏡檢。
 

　　IHC(冰凍切片)實(shí)驗(yàn)怎么做
 

　　一、冰凍
 

　　將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)(直徑約2cm)，如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。
 

　　注意：針對(duì)儲(chǔ)存在-80℃溫度下的組織，切片前，從冷凍柜中取出組織樣品，在-20℃的溫度下均衡約15分鐘。這樣可以防止切片在封閉時(shí)破裂。
 

　　二、切片
 

　　用OCT包埋劑浸沒(méi)組織。將組織切成厚度在6-8μm之間的切片，置于多聚賴氨酸粘附的載玻片上。固定前，將切片放置在工作臺(tái)上風(fēng)干幾分鐘(這樣可以增加切片的粘附作用)。
 

　　三、固定
 

　　選擇適宜的固定劑，可采用丙酮固定，-20℃下冷凍10分鐘，風(fēng)干。
 

　　之后，同上面實(shí)驗(yàn)步驟：滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶→封閉→抗體結(jié)合→底物顯色→復(fù)染→分化→脫水透明→封片→鏡檢。