產(chǎn)品名稱:第1鏈cDNA合成試劑盒
英文名稱:RT EasyTM(For first-strand cDNA synthesis)
產(chǎn)品規(guī)格:25 rxns 100 rxns
產(chǎn)品貨號:RT-01011
保存說明:短期室溫，*2-8℃
產(chǎn)品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應(yīng)
英文名稱:RT EasyTM(First-strand cDNA for Real Time PCR)
產(chǎn)品規(guī)格:50 rxns 200 rxns
產(chǎn)品貨號:RT-01021
產(chǎn)品描述:第1鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR
第1鏈cDNA合成試劑盒注意事項:
1、確保RNA完整性及純度。RNA質(zhì)量是決定合成cDNA第1鏈成功的關(guān)鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應(yīng)進一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須*無菌。操作過程始終戴手套以杜絕各種RNA酶的污染。
3、 合成cDNA第1鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉(zhuǎn)錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通?？傻玫浇咏L的cDNA第1鏈;若選擇隨機寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個mRNA的多個位點退火,產(chǎn)生短的部分長度的cDNA第1鏈。這種方法經(jīng)常用于獲得5’末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。
第1鏈cDNA合成試劑盒操作方法:
1、 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
(1) 在無菌薄壁管中加入以下成份:
Total RNA 0.5-1.0µg
(dN)9 or oligo(dT)18 100pmol
(2) 混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
5×M-MLV Buffer 4µl
dNTPs(10mM each) 1µl
RNasin 10U
100mM DTT 2µl
M-MLV Reverse Transcriptase 100U
DEPC-treated water up to 20µl
(3) 混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時在42℃，使用隨機引物(dN)9時在37℃下溫育1小時。
(4) 94℃ 5min終止反應(yīng)后,冰上冷卻。
(5) 合成的cDNA第1鏈可直接用于PCR擴增或進行其它下游操作。
